1、操作之前首先讲一下大概原则：1、一侧引物（上/下游）尽量位于载体质粒骨架上，另一侧位于插入目的基因序列上。2、PCR产物大小不宜超过1000bp或小于200bp。3、特殊情况时，亦可选用仅扩增部分插入片段的引物对（一般不建议，须同时辅助其他验证手段）。
2、接下来，咱们开始演示如何使用primer 3 plus来设计筛选引物。 打开primer 3 plus 引物设计页面，http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi
3、输入序列ID至下图编号1处，或复制粘贴或导入引物设计所需的模板序列（建议：部分质粒骨架序列+目的基因序列）至“Main”页面下空白对话框（编号2）处。滤鲇魍童设置“Load server settings”为”Default”， 同时 “Task”右侧下拉对话框，选择“generic”
4、点击下方“General Settings”进入子页面，于“Product Size Ranges”敫嘹萦钻右侧对话框中输入产物bp数值范围（建议：500左右最佳。过大（>1000bp）增加PCR反应时间，太小（<150bp）不易与引物二聚体区分），可默认此页面其他参数不变
5、点击“Advanced Sequence”进入子页面，于“Force Left/Right Primer Start”右侧对话框中输入上游（左）/下游（右）引物起始位置序号（此操作即可将上游/下游引物设置在质粒骨架上）。
6、然后点击右上方“Pick Primers”，即可跳转至结果页面
7、方法二：如果已知上游（左）/下游（右）引物，可直接在“Main”页面下“or use left primer below”或“or use right primer below”处输入引物序列。再如步骤4操作限定产物大小，“Pick Primers”即可获得结果
8、最后只需要导出引物序列送公司合成
